Perturb-seq とは

Perturb-seq(CRISP-seqおよびCROP-seqとも呼ばれる)は、プールされた遺伝子摂動スクリーン上で単一細胞RNA配列決定(scRNA-seq)を行うハイスループットの方法を指す。 Perturb-seqは、多重摂動CRISPR媒介遺伝子不活性化と単一細胞RNA配列決定を組み合わせて、各摂動の包括的な遺伝子発現表現型を評価する。遺伝的摂動を適用して遺伝子をノックダウンまたはノックアウトし、結果として生じる表現型を研究することによって遺伝子の機能を推測することは、逆遺伝学として知られている。 Perturb-seqは、トランスクリプトームのレベルで表現型の調査を可能にする逆遺伝学的アプローチであり、大量の細胞で遺伝子機能を解明するために、大規模に並列しています。
Perturb-seqプロトコルはCRISPR技術を使用して、各ガイドRNAの特定の遺伝子およびDNAバーコードを不活性化し、すべての摂動を一緒にプールし、その後デコンボリューションし、各表現型を特定のガイドRNAに割り当てることができます。個々の細胞を単離するために、小滴ベースのマイクロ流体プラットフォーム(または他の細胞選別および分離技術)が使用され、次いで、各細胞の遺伝子発現プロファイルを生成するためにscRNA-seqが実施される。プロトコルの完了時に、各特定の細胞および摂動を、各遺伝子を不活性化することの結果を特徴付けるトランスクリプトームプロファイルと関連付けるために、バイオインフォマティクス分析が実施される。
Cellジャーナルの2016年12月号には、このテクニックを導入して記述した2つのコンパニオン・ペーパーが掲載されています。概念的に類似したアプローチ(CRISP-seqと呼ばれる)を記述する第3の論文も同じ問題で発表された。 2016年10月、シングルセルCRISPRスクリーニングのCROP-seqメソッドがbioRxivのプレプリントに掲載され、その後Nature Methodsジャーナルに掲載されました。各論文は、CRISPRが仲介する摂動とscRNA-seqを組み合わせるという基本原則を共有していましたが、実験的、技術的、分析的アプローチがいくつかの側面で異なり、異なる方法論を幅広く実証しました。例えば、CRISPR-seq論文は、この技術を用いたインビボ研究の実現可能性を実証しており、CROP-seqプロトコルは、(発現したバーコードに頼るのではなく)ガイドRNA自体を可読にするベクターを提供することにより、シングルステップガイドRNAクローニング用です。